PGK1是一种葡萄糖代谢酶,可能在类风湿性关节炎中发挥重要作用

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针灸读书会 发表于 2018-10-29 13:56:46 | 显示全部楼层 |阅读模式

葡萄糖代谢是体内主要的代谢途径之一,主要是指葡萄糖降解过程,包括糖酵解,有氧氧化和磷酸戊糖代谢。 葡萄糖代谢不仅为身体活动提供能量,而且通过形成复杂的信号传导网络介导各种生理过程。 类风湿性关节炎(RA)是一种自身免疫性疾病, 近年来,一些研究结果表明,葡萄糖代谢在RA的发病机制中起重要作用。然而,迄今为止尚未彻底研究葡萄糖代谢对RA发病机理的影响。

RT2 Profiler™PCR Array是一种96孔板上的实时PCR引物分析,是一种可靠且灵敏的基因表达谱分析技术,用于分析信号转导途径,生物过程或疾病相关基因网络中的一组基因。 在目前的研究中,我们利用葡萄糖代谢RT2 Profiler™PCR阵列来研究胶原诱导的关节炎(CIA)大鼠的葡萄糖代谢。 基于上述分析,本研究调查了靶基因在RA滑膜组织和培养的RA滑膜成纤维细胞样细胞(RASF)中的表达和致病作用。 目前的研究目的是筛选RA中葡萄糖代谢的重要酶。

材料与方法

1.在大鼠中建立胶原蛋白II诱导的关节炎(CIA)模型

将雄性Wistar大鼠(n=20,150-200g)随机分为两组:CIA组和对照组。所有实验大鼠在尾部背部和尾部皮内注射含有500μg牛胶原蛋白II的0.2ml完全弗氏佐剂(CFA),14天后使用相同方法进行加强注射。对照组用牛血清白蛋白(BSA)代替胶原蛋白II处理。第一次注射后第28天,收集双侧膝关节滑膜组织并立即放入-80℃冰箱中。

2.收集人类RA滑膜和血液样本

在患有RA的患者的膝关节置换手术期间收集滑膜组织样品(n  = 8,7女性,50-68岁,平均55岁)。RA患者的病程为3至9年,并被归类为具有侵蚀性RA(Larsen IV-V级)。 在膝关节置换手术期间收集来自OA患者(n = 8,2女,34-53岁,平均35)的滑膜组织样品。从结缔组织切下滑膜样品并立即储存在-80℃直至使用。

通过标准静脉穿刺从RA (n  = 120,75名女性,年龄20-74岁)的患者获得血液样品。患者的关节慢性炎症至少3年,红细胞沉降率高(ESR,19-22 mm / H,平均44 mm / H),C反应蛋白(CRP,8-196 U / ml,平均值29.1)和风湿因子(RF,10.5-2090U / ml)。共有120名(80名女性; 24-58岁,平均40.2名)健康个体是献血者。

结果

1.在CIA滑膜组织和人RA滑膜组织中具有葡萄糖代谢的替代表达的基因

用大鼠葡萄糖代谢PCR阵列分析在CIA滑膜组织中具有葡萄糖代谢的替代表达的基因。与对照滑膜组织相比,在CIA大鼠的滑膜组织中检测到具有至少4倍差异表达的5个基因。在CIA滑膜组织中,烯醇酶1(ENO1),己糖激酶2(HK2)和磷酸甘油酸激酶1(PGK1)基因的表达上调,而磷酸烯醇 - 丙酮酸羧激酶1(PCK1)和丙酮酸脱氢酶激酶同工酶4(PDK4)基因表达下调。 结果如图1a所示。

在每个CIA滑膜组织中使用实时PCR验证结果。与对照大鼠组织相比,CIA大鼠滑膜组织中ENO1,HK2和PGK1 mRNA水平显着升高,而CIA大鼠滑膜组织中PCK1 mRNA和PDK4 mRNA水平降低(图1b)。

使用实时PCR和蛋白质印迹分析在RA滑膜组织中检查这五种基因的转录水平。与在OA滑膜组织中观察到的相比,人RA滑膜组织中ENO1和PGK1的mRNA水平显着升高。RA滑膜组织中PDK4 mRNA的水平远低于OA滑膜组织中的水平。在RA滑膜组织中未观察到HK2和PCK1的显着替代表达(图2)。

使用蛋白质印迹分析确定RA患者的滑膜组织中ENO1,HK2,PDK4和PGK1的表达。通过GAPDH表达将表达归一化。RA滑膜组织中ENO1和PGK1的表达水平显着高于其OA滑膜组织。

2.RA患者血液中ENO1,HK2,PDK4和PGK1的血清水平

夹心ELISA用于测量RA患者血液中ENO1,HK2,PDK4和PGK1的水平。与来自健康的样品相比,来自RA患者的样品中PGK1水平显着增加。此外,30.2%的RA样品显示PGK1水平是健康受试者平均水平的两倍。RA样本中ENO1水平略有增加,但这种差异不显著。只有9%的RA样本表现出的ENO1水平是健康受试者平均水平的两倍。RA患者和对照之间的血清PDK4和HK2水平没有显着变化。结果如图4所示  。

3.培养的RASF中的细胞因子水平,细胞增殖和细胞迁移

为了确定抗PGK1 siRNA在培养的RASF中的作用,使用实时PCR和蛋白质印迹分析测定PGK1的mRNA水平。与用非沉默siRNA转染的样品相比,抗PGK1处理的RASF中的PGK1转录显着下降。在RASF中检测到大小为47kDa的PGK1蛋白,并且与非沉默siRNA处理的RASF和未处理的RASF样品相比具有显着降低的表达。这些结果证明PGAS1的表达被RASF中的抗PGK1 siRNA有效抑制。结果如图5所示  

图5 确定siRNA处理的RASF中的PGK1蛋白水平和上清液中的IL-1α,IL-β,IL-γ和TNF-α水平。

A. PGK1转录物通过实时PCR在用抗PGK1 siRNA处理的细胞RASF检测。

B.用抗PGK1 siRNA处理的RASF中的PGK1蛋白表达。

C.将蛋白质表达水平标准化为GAPDH的表达。上述结果表明,在RASF中抗PGK1 siRNA有效抑制了PGK1的表达。

D.IL-1α,E. IL-1β,F.IFN-γ和G.TNF-α 通过ELISA测量,检查siRNA处理的RASF的上清液中的水平。

在抗PGK1 siRNA处理的RASF中IL-1β和IFN-γ水平显着下降。


使用CCK-8细胞增殖测定和transwell测定检查抗PGK1 siRNA对RASF细胞增殖的影响。在用抗PGK1 siRNA转染72小时后,与具有非沉默siRNA或不用siRNA处理的样品相比,在抗PGK1 siRNA处理的RASF中观察到明显降低的细胞增殖。其结果示于图  6一个。同时,与非沉默siRNA处理的RASF(298.3±8.33,p  = 0.001)相比,当用抗PGK1 siRNA 处理RASF持续72小时,在transwell装置的低室中观察到显着低数量的RASF细胞(55.3±7.37)(55.3±7.37)。该观察结果表明PGK1表达沉默RASF中细胞迁移的抑制能力受到抑制。结果如图6所示。尽管非沉默siRNA处理后的RASF也显示出比没有siRNA处理的细胞更低的细胞增殖,但是抗PGK1 siRNA处理后的RASF显示出比处理非沉默siRNA的细胞低得多的细胞增殖。尽管siRNA转染过程本身可能对细胞造成损害,但该观察结果表明抑制PGK1对细胞增殖的影响。相同的解释适用于用siRNA处理的RASF中IL-1β和IFN-γ的抑制分泌。

讨论


本研究在CIA滑膜组织中PCR阵列检测到5个具有显著替代表达的基因。ENO1,HK2和PGK1具有上调的表达,并且PDK4和PCK1具有下调的表达。通过CIA大鼠的每个滑膜组织中的实时PCR验证该结果。此外,在RA患者的滑膜组织中检测到ENO1和PGK1的mRNA表达增加以及PDK4的mRNA表达降低。在患病组织中通过蛋白质印迹分析也证实了ENO1和PGK1的升高的蛋白质水平。这些结果表明,两种重要的乙二醇代谢酶ENO1和PGK1在CIA和人类RA滑膜组织中的表达增加。此外,夹心ELISA检测到RA患者血液中PGK1的表达增加。

在目前的研究中,我们检测到抗PGK1 siRNA处理的RASF中IL-1β和IFN-γ水平降低。RA病理学是由许多细胞因子,包括TNF-α,IL-1,IL-6,IL-17,IFN-γ等介导的。IL-1β和IFN-γ被认为最近被在关节炎治疗潜在的新靶标。我们的研究检测到RA滑膜组织中PGK1的表达增加。虽然基因抑制的作用并不总是与基因过表达相反,但本研究使用siRNA抑制PGK1表达表明PGK1通过介导IL-1β和IFN-γ的产生参与RA促炎症。此外,目前的研究检测到抗PGK1 siRNA处理的RASF中细胞增殖和细胞迁移能力的显著降低。该观察结果表明,糖酵解的中断可能对RASF细胞生长产生影响。RA的特征在于滑膜增生和关节组织的进行性破坏。通过促进滑膜组织的过度生长,细胞增殖失调或细胞凋亡减少等因素可直接影响RA的病理结果。PGK1也在肿瘤组织中,如结肠癌和胃癌的肿瘤检测,并且被证明与肿瘤转移有关。有研究发现PGK1参与血管生成的功能是减少丝氨酸蛋白酶纤溶酶中的二硫键,从而导致肿瘤血管抑制剂血管抑制素的释放。血管抑制素对滑膜炎症和血管生成的治疗非常重要。


总之,我们的研究确定了在CIA和RA滑膜组织中PGK1和ENO1(两种重要的糖酵解酶)的表达增加。我们还检测到RA患者血液中PGK1水平升高。体外实验表明,PGK1可以影响RASF中IL-1β和IFN-γ的产生,并调节RASF细胞增殖和细胞迁移能力。这一发现为理解RA的发病机制提供了新的视角。


文献来源:

Zhao Y1, Yan X1, Li X.PGK1, a glucose metabolism enzyme, may play an important role in rheumatoid arthritis.Inflamm Res. 2016 65(10):815-25. https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs00011-016-0965-7.


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